Polyakryyliamidigeelielektroforeesin varotoimet

· polyakryyliamidigeelin on koostuttava akryyliamidimonomeerista, polymeroinnin lähtöaineesta, katalyytistä sekä oikeasta suola- ja puskuriseoksesta.

· akryyliamidija BIS (N,N'-metyleeni-kaksoisakryyliamidi) on monomeerimuotoinen geelimatriisi.

· ammoniumpersulfaatti käynnistää liiman polymeroitumisprosessin. Liiman formulointi vaatii 10-prosenttista ammoniumpersulfaattiliuosta, joka on valmistettu veteen. Suurin osa tiedoista viittaa aktiivisen käytön tarpeeseen. 10-prosenttista liuosta voidaan kuitenkin pitää 4 ℃:ssa useita viikkoja ilman merkittävää aktiivisuuden menetystä. Laimenna 10 ml:aan asti ja hävitä, kun liima ei enää aggregoidu.

Vinkki: ProsenttiosuusakryyliamidiSekvensointiliiman ja proteiiniliiman käyttö ei ole sama asia. Jos käytät valmiiksi valmistettua akryyliamidi:BIS-liuosta, varmista, että saat oikean pullon.

· TEMED (N, N, N', N'- tetrametyylietyleenidiamiini) on katalyytti, joka on pakattu ruskeaan pulloon ja laitetaan jääkaappiin. Se lisätään juuri ennen liiman kaatamista.

· polyakryyliamidielektroforeesissa käytetty lasi tulee pestä ennen jokaista käyttökertaa ja sen jälkeen. Elektroforeesin jälkeen pese pehmeällä harjalla ja liinalla kuumassa saippuavedessä, huuhtele tislatulla vedellä ja anna kuivua.

· kosteus ja pöly voivat aiheuttaa kuivumista onttojen polymeerien kanssa. Ennen elektroforeesia puhdista lasilevy lasinpuhdistusaineella ja pyyhi se pehmeällä harjalla. Pese tislatulla vedellä ja kuivaa huolellisesti talouspaperilla. Huuhteleminen 70-prosenttisella etanolilla ennen talouspaperilla pyyhkimistä auttaa puhdistamaan levyä ja nopeuttamaan kuivumista. Lisää akryyliamidinäytteet peräkkäin: BIS, vesi, puskuriliuos, ammoniumpersulfaatti, TEMED. Ravista hyvin ja kaada heti.

Polyakryyliamidin kaasunpoisto ei ole tarpeen ennen polymerointia. (Akryyliamidi asetettiin aiemmin tyhjiöön kuplien poistamiseksi, koska happi estää polymerointia.)

Vaakasuorat liimapisteiden näytekärjet.

· Laita musta paperiarkki pohjaan, musta tausta, jotta voit tehdä näytereikä nähdäksesi paremmin.
· liimasäiliöllä täytetty puskuri, juuri kolloidin yläpuolella.
· Jos reunassa on valo, sytytä valo ja anna valon paistaa kolloidisesti. Vedä näyte pipettiin.
· automaattisen pipetointilaitteen käyttö.
· 10–200 mikrometrin rei'issä useimmissa näytteen pisteissä voidaan käyttää yhtä nestettä liikuttavaa pistettä. Hyvin pienille näytereikille (alle 10 μ1) on kätevämpää käyttää liiman sekvensointiin käytettyä pitkää pipetin päätä.

· pipetointi juuri näytteeseen upotettuna, hitaasti liikkuvan nesteen hengittäminen. Näyte voi näyttää tahmealta glyseriinin vuoksi, ja nopea pumppaus voi vetää ilmakuplia pipetin päähän.

· Näytteiden hengittämisen jälkeen pipetointipää liikuttaa nestepäätä varovasti putken reunalla tai pyyhkii paperilla imemällä nestepään pisaroiden ulkopuolelle. Varo imemästä näytettä.

Aseta näyte näyteaukkoon

· pipetointilaite pitää hieman painetta, jotta näytteet liikkuvat hieman ylivuotonestepään yli.
· pipetointipää asetetaan puskuriin, hieman pistereikiä korkeammalle, jotta positiivinen paine säilyy. Pipetin kärki voidaan asettaa pieneen reikään.
· pumppaa näytteet hitaasti ja tasaisesti ulos. Pipetin kärki asetetaan näytereiän yläpuolelle, ja näyte uppoaa reikään. Anna näytteen upota täyttääksesi näytereikä sen sijaan, että se työntyisi sisään.
· Kun viimeinen näytepisara nestepäässä on nestettä, se siirtyy toiseen jalkaan, nosta nestettä hitaasti ja siirry ulos puskurista

Miten vertikaalinen liimanäytteenotto tehdään?

· kahden lasinpalan väliin muodostetut pystysuorat liimapisteen näytereiät. Hyvin ohuessa liimassa pipetin päätä ei voida edes asettaa kahden lasilevyn väliin. Varo glyseriiniä! Aseta pipetin pää näytereiän päälle, niin näyte uppoaa reikään.
· piste näytettä ennen, muista asettaa polypropeenin asyyligeelin pystysuora piste näytereikään ja huuhdella se puhtaaksi. Pese pois polymeroitumaton akryyliamidi ja vesi, jota saattaa ilmestyä näytereiän pohjalle. Vesi voi pienentää näytereikää merkittävästi. Käytä 25 ml:n tai 50 ml:n ruiskua ja 18-kaliiperista neulaa. Kaada elektroforeesipuskuri sisään ja huuhtele näytereikä huolellisesti.
· näytereiän näkeminen voi olla vaikeaa, mutta samaan aikaan loput on helppoa. Jos reikiä on liikaa, näytepuskuria voidaan testata bromifenolisinellä.